1. 方法

1.1　动物选择
1.1.1 选择体重在200~300g的雄性纯白豚鼠。

1.2　试剂和仪器
1.2.1 主要试剂及仪器包括标准低分子蛋白 (M.W.14000~94000)、刀豆素 A (ConA)、羊抗豚鼠IgG抗体-HRP、高速分散器(GF-Ⅰ型)、β-计数仪、酶标记比色仪(EL-309型)等。

1.3　方法
1.3.1 牛坐骨神经髓鞘碱性蛋白(MBP)的提取与鉴定
在London的方法的基础上进行了改良：将100克新鲜牛坐骨神经剪碎后加入适量预冷(-4℃)的氯仿/甲醇(2∶1)中，使用高速分散器(GF-Ⅰ型)匀浆，加入氯仿/甲醇(2∶1)混合液至1000毫升，4℃下搅拌12小时，用布氏漏斗过滤脱脂，取出沉淀物后加入氯仿/甲醇(2∶1)混合液500毫升，搅拌2小时，使用同样的方法过滤2次，取出沉渣后加入预冷的(-4℃)的丙酮500毫升，搅拌2小时，再用同样的方法过滤并重复1次。将沉渣加入1000毫升双蒸水，并在4℃下搅拌12小时，同时使用同样的方法过滤并重复1次，然后在4℃下离心(12500g/min×10min)，去除上清液，用180毫升双蒸水将沉渣溶解，用1mol/LHCl调整pH值至3.00，搅拌60分钟后再在4℃下离心(12500g/min×60min)。取出上清液，并使用透析膜透析后使用聚乙二醇(PEG：分子量20000)浓缩，最终置于-60℃冰箱中存储备用。提取后的MBP用考马斯亮兰染色法进行蛋白质浓度测定，使用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行蛋白条带的观察。

1.3.2　MBP诱导豚鼠实验(EAN)
将MBP溶液(3mg/ml)取1ml，加入完全福氏佐剂(CFA：含75mg/ml的卡介苗0.5ml，不完全福氏佐剂1.5ml)中，并在乳钵中碾磨加乳化，多点注射入豚鼠背部皮下，MBP用量为300μg/只。

1.3.3　EAN发病评分标准
根据国际上EAN评分标准，将发病程度分为0~5级，0级：无异常；1级：两后肢脚趾轻微拖拽地面；2级：两后肢脚趾较明显拖地，但未累及其它部位；3级：两后肢显著拖地，常见两后肢偏向同一侧；4级：两后肢完全瘫痪；5级：四肢均受累，甚至呼吸抑制。

1.3.4　病理形态学观察
①神经组织的HE染色：豚鼠死亡后迅速取出大脑、小脑、脊髓、脊神经根及坐骨神经等，并进行HE染色观察。②甲苯胺蓝染色显示神经髓鞘：豚鼠死亡后取坐骨神经进行甲苯胺蓝染色观察。③单根神经纤维标本的制作：神经组织用10.0%的福尔马林固定，再用1.0%的锇酸固定，在解剖显微镜下撕单根神经纤维光镜下观察。

1.3.5 运动神经传导速度(MNCV)及复合肌肉动作电位的记录
①电极放置位置：近端刺激电极插入坐骨结节附近，远端刺激电极插入踝关节上0.2cm肌肉内，记录电极一支插在掌面肌肉内，一支插在小趾掌趾关节附近，接地电极插在大腿表皮下。②记录方法：豚鼠麻醉，先记录近端复合肌电(PCMAPs)，调整近端刺激电极位置，以持续时间0.05ms、强度35V的刺激能诱发出肌电时的电极位置为最佳，增强刺激强度，至诱发出最大PCMAPs时，再将刺激强度加大50.0%，以此值作为刺激电压值，连续刺激15次，对所诱发的PCMAPs进行摄影并将15次波形重叠在1张胶片上，以重叠最多处为标准，算出PCMAPs潜伏期及波幅大小。记录完成后，使用同样的方法记录远端复合肌电(DCMAPs)及远端F-波(即紧接DCMAPs的反射波)的潜伏期。最后，根据PCMAPs与DCMAPs潜伏期的差值及两对刺激电极间的距离可算出MNCV。

1.3.6　脾淋巴细胞转化试验
采用微量3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法，丝裂原分别为ConA和MBP。

1.3.7　检测豚鼠血清中特异性抗MBP-IgG抗体的滴度
采用ELISA(间接法)方法进行检测。

1.3.8　统计学处理
实验数据均用均数±标准差()表示，使用t检验进行两组间差异显著性的比较。

北检院部分仪器展示