2.5.5.1  小鼠尾巴DNA萃取方法

小鼠尾巴组织是获取小鼠DNA的主要来源，同时为了能对小鼠进行逐一辨认，常使用剪小鼠脚趾的办法进行编号。具体操作步骤如下：

1. 取断乳期（生后2～3周）乳鼠，无菌减去鼠尾约3mm，放入1.5mL离心管中并进行标记。

2. 手术器械每次操作使用不同器械，并用酒精棉球擦拭灼烧后使用。

3. 对乳鼠进行编号，以后方便随后检测结果对应及查找。

4. 具体DNA萃取步骤如下：

(1) 在离心管中加入350µL鼠尾组织缓冲液和35µL蛋白酶K，55℃孵育并振荡混匀过夜。

(2) 离心，转移上清液至新管并加入等体积的饱和酚抽提上清液。

(3) 加入等体积的酚：氯仿：异丙醇(25：24：1)(V/V/V)，抽提上清液。

(4) 加入等体积的氯仿：异丙醇(24：1)(V/V)抽提上清液。

(5) 加入0.4倍体积(约154µL)DNA沉淀溶液，混匀后放置冰上2h，或4℃过夜。

(6) 室温离心6 min，弃上清液。

(7) 加入1 mL 70%乙醇，轻轻颠倒离心管几次，室温离心2 min，立即弃上清液，可见沉淀的DNA。重复本步骤一次。

(8) 干燥30 min后，加入100µL的TE缓冲液混匀。取5µL测OD₂₆₀值。

2.5.5.2   PCR检测方法

PCR（聚合酶链反应）是一种在体外复制DNA分子的技术。通过PCR检测可以检测到转基因DNA的存在，具体操作步骤如下：

1. 确定PCR产物的大小范围，常扩增200～1,000 bp的靶序列即可。

2. 设计和制备合适的引物，引物一般可以设计两对进行扩增。

3. 对照设定，取1~2 pg的质粒DNA作为阳性对照，同时还需要做阴性对照，以检测测试剂或材料是否污染。

2.5.5.3   Southern Blot检测方法

当PCR方法无法确定转基因阳性时，可以采用Southern Blot检测方法。通常用基因组Southern blot来筛选founder小鼠和大鼠，以建立稳定的遗传品系。但如果要从插入转基因的杂合品系中分出纯合品系，则不能使用本方法。

具体操作方法如下：

1. 琼脂糖凝胶电泳：消耗5倍质量的限制性内切酶对5~10µg鼠尾基因组进行消化，并使用琼脂糖凝胶电泳分离各个酶解DNA片段。

2. 硝酸纤维素薄膜转印：使用变性缓冲液和中和缓冲液对琼脂糖凝胶

北检院部分仪器展示