2.39.1 质粒DNA

在这个实验中，我们使用了两个质粒，分别为pQE-31和pUC18-CAT质粒。

2.39.2 制备重组DNA

(1) 在一个灭菌的1.5mL离心管中，加入10ml（2mg/mL）的pQE-31质粒，2mL的酶切缓冲液，1mL的BamHI和HindIII酶混合液（各含10个单位），加入无菌双蒸水7mL，总体积为20ml，并在37℃下反应过夜。

(2) 在另一个无菌的1.5mL离心管中，加入20ml的pUC18-CAT质粒，加入3mL的酶切反应液，1mL的BamHI和HindIII酶混合液，加入无菌双蒸水补到30mL，并在37℃下反应过夜。

(3) 取5ml的pQE-31质粒酶切液进行电泳分析，检验酶切是否完全。若酶切完全，则进入下一步。

(4) 将酶切处理后的pQE-31和pUC18-CAT质粒分别上样到琼脂糖凝胶电泳中（需要注意加入DNA分子量标准）。当电泳结束后，使用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照说明书回收DNA片段。pQE-31回收片段的长度为3.5kb，pUC18-CAT回收片段的长度为650bp。

(5) 将回收的pQE-31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，进行连接操作; 另一份则不加CAT片段做对照。操作如下：在10ml的DNA样品中，加入1mL的T4 DNA连接酶缓冲液和1mL的T4 DNA连接酶。将反应混合液在14℃（室温）下过夜，然后进行大肠杆菌的转化。

2.39.3 转化感受态细胞

(1) 准备保存在-20℃的感受态细胞。

(2) 在100mL融化后并处于冰浴中的感受态细胞中，加入10mL连接产物并混匀，然后放在冰上30分钟。随后，按照实验一的操作进行，并对没有加CAT片段的空白pQE-31载体质粒进行连接操作，作对照组。

2.39.4 结果检测

在过夜的培养后，实验组和对照组的培养皿中都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但需要进一步鉴定实验组中的菌落是否含有所需的DNA重组子。

北检院部分仪器展示