在保留宿主基因组序列的前提下，通过定点插入外源基因并控制其高效表达，可以通过人为控制插入位点来有效避免基因插入内源基因外显子产生突变、干扰其表达的可能性，确保转基因实验的可靠性。

然而，在选择敲入位点上，研究者们最初并没有一个明确的标准和选择。直到ROSA26位点的发现，基因敲入小鼠的研究才开始变得普遍和高效。ROSA26位点是在用反转录病毒对ES细胞进行基因捕获时发现的，其中原本表达的两个核RNA转录本消失，而同时β-gal高效且广泛表达。因此，该位点被广泛应用于生产基因敲入小鼠，并被用于生产LacZ/Cre基因敲入小鼠，取得了良好的实验结果。

通常情况下，ROSA26敲入是将外源基因编码区插入ROSA26位点的第一内含子中，限制性内切酶XbaI位点处。同时插入的片段中还包含正负筛选基因新霉素抗性基因和白喉毒素基因，以此来筛选高效率的同源重组。在G418抗性克隆中，同源重组率可以达到25％～50％。

图3-13  将外源荧光报告基因导入Rosa位点策略

ROSA26位点被广泛应用的主要原因是其广泛、均一的启动子表达，尽管不同研究中表达效果有所差异。对于动物模型研究来说，具有这种广泛表达的普遍活性是非常有意义的。随后许多ROSA26基因敲入小鼠模型陆续出现，被广泛应用于医学等研究领域，ROSA26也成为了应用最广泛的基因敲入位点。

除了定点插入外源基因，基因敲入还可以利用同源重组实验特定靶基因的点突变，从而改变该基因的内源表达状态，以研究基因区域功能和影响。

ROSA26位点的成功应用解决了转基因动物插入位点不确定、无法预测表达量的问题，但是，一直以来，基因全身表达也一直困扰着基因敲入动物研究。外源基因全身性表达可能会引起一些不可预知的表型。大多数研究者关注的是该基因对体内某些特定组织、器官或部分区域的影响，全身性表达无疑会让科学研究变得复杂化。此外，某些外源基因的持续表达会引起动物在胚胎期或孕期致死，从而无法获得基因敲入动物后代，另外，点突变基因表达也可能会影响正常表型。这也提出了调控转入基因时空特异性表达的问题。为了解决这个问题，研究者们在基因打靶的基础上加入了Cre/loxP重组体系，用于调控外源基因表达。

北检院部分仪器展示