材料与方法

1、材料

1.1 实验动物

本研究使用的是SPF级雌性BALB/c小鼠共70只，体重为13~15克，由北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京) 2012-0001】提供。动物实验在中国医学科学院医学实验动物研究所生物安全三级实验室中【卫ABSL3-021】进行，并已通过中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物伦理委员会的审查，批准号为【ILAS-PS-2013-006】。

1.2 毒株

A/Anhui/1/2013（H7N9）禽流感病毒由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所提供。

1.3 仪器和试剂

血常规检测仪器为Beckman ACT TM Coulter，产自美国。麻醉用盐酸氯胺酮产自沈阳兽药厂，批号为20130325；免疫组化试剂使用的是甲型流感病毒NP蛋白小鼠单抗，购自IRR公司，货号为FR-51。二抗及DAB显色剂选用的是北京中杉金桥产品，货号为PV-9001、ZLI-0001。

2、方法

2.1 动物分组

本研究将小鼠按体重随机分为生理盐水对照组、高感染剂量组、中感染剂量组和低感染剂量组，每组10只，分别接种1×10^8、1×10^7或1×10^6 TCID50的病毒，用于观察临床症状和死亡率。另外，还选取30只小鼠接种1×10^6 TCID50的病毒，攻毒后1、2、3、5、7天随机挑选6只小鼠安乐死，用于病毒载量检测和组织病理学观察。

2.2 攻毒

小鼠用浓度为20mg/mL的盐酸氯胺酮注射液进行肌肉注射麻醉，每只小鼠麻醉剂量为0.1mL。然后利用移液器将50μL的1×10^8、1×10^7或1×10^6 TCID50的H7N9禽流感病毒原液点滴入小鼠鼻腔，对照组小鼠点滴入50μL生理盐水。接着，给予正常饲养，供给饲料量为标准日粮，饮水用高压灭菌水，足量供给。

2.3 观察指标

攻毒前的时刻记为0天，攻毒后的14天内每隔24小时观察一次，包括小鼠的活动、反应性、饮食、呼吸、有无弓背、竖毛、蜷缩、颤抖以及死亡率等指标。每天使用电子秤测量体重。

2.4 病理检查

攻毒后的1、2、3、5、7天随机挑选3只小鼠安乐死，取心、肝、脾、肺、肾、脑、肠等组织用于病理标本制备。该方法采用甲醛固定、石蜡包埋、切片，以及HE和免疫组化染色。免疫组化染色采用SP法：一抗稀释度为1：200，在4℃过夜，PBS洗涤。加入二抗，孵育于室温10分钟后，用PBS洗涤。然后用DAB显色，苏木素染色衬底后，脱水、透明、中性树脂封片。

2.5 病毒载量和抗体测定

攻毒后1、2、3、5、7天随机挑选3只小鼠安乐死，用生理盐水对肺组织进行灌洗，取肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）和肺、心、肝、脾、肾、脑、肠等组织接种到MDCK细胞上，并观察细胞的病变情况。攻毒后第14天摘取眼球取血，离心取上清，使用血凝抑制法（Hemagglutination Inhibition Test，HI）进行抗体滴度检测[3]。

2.6 白细胞计数

攻毒后1、2、3、5、7天摘取小鼠眼球取抗凝血，进行白细胞总数和分类计数。

2.7 统计学方法

该研究的数据以（均值±标准差）表示，数据应用SPSS13.0软件包进行统计处理。组间比较采用方差分析的两两q检验，而率的比较则采用卡方检验。以P<0.05和P<0.01表示具有统计学意义。

北检院部分仪器展示