1.雪貂感染H5N1实验中的血清学筛选

在进行雪貂感染H5N1病毒实验前，需要进行血清学筛选以保证实验结果的可靠性。必须检测雪貂的血清抗体，包括H5N1病毒抗体及当前流行的流感病毒抗体，检测结果必须为阴性的才能入组。

2.实验用材料及方法

(1)实验用病毒：从SPF鸡胚中提取尿囊液经传代获得，经过确认病毒液TCID50为10的8次方/ml。

(2)动物及感染方法：选取4～10月龄，体重介于500～1000g的雪貂。感染前进行血清抗体检测，检查H5N1病毒抗体及当即流行的流感的抗体为阴性的雪貂方可入选实验，接种病毒液的剂量为100TCID50(500μl体积)，采取鼻腔接种方法。实验过程在ABSL-3实验室中进行。感染第5天时，进行安乐处死并取材。

(3)临床观察：在实验前给雪貂皮下植入芯片，并记录每天的体温及体重变化，观察雪貂有无咳嗽、流涕、呕吐、腹泻、气促、呼吸困难、明显食欲缺乏等临床表现，并详细记录。

(4)病毒分离：感染后第1天起每天收集鼻甲骨活检物标本，放入1ml DMEM培养液中备用。标本接种MDCK细胞，观察病毒在细胞中的生长情况。在感染第5天时，感染的雪貂进行安乐处死，并取样进行病毒生长情况的观察。此时可以在肺、气管、肝、脾、脑、肠、心和肾组织中分离到活病毒。

(5)H5N1病毒RNA的检测：在H5N1病毒接种动物后，每天收集鼻甲骨活检物，提取病毒RNA，在ABSL-3实验室内进行操作。将RNA逆转录成cDNA并通过荧光定量PCR仪直接测定病毒载量。

(6)H5N1病毒抗体检测：在感染后，采集雪貂静脉血进行H5N1病毒特异性抗体检测，检测结果必须为阴性。

(7)病理学研究：在感染后第5天进行安乐处死，并进行大体观察。具体包括肺、心、脾、肾、肝、脑、肠以及淋巴结等组织的形态变化，制备病理切片，进行HE或免疫组织化学染色后进行镜检观察。

3.雪貂感染H5N1模型的指标和结果

在实验前1周测定雪貂的正常体温和体重，确定正常值后，进行病毒感染实验。在接种病毒2天后，雪貂体温升高0.5～2℃，持续3天左右。实验发现雪貂在感染后出现流涕，打喷嚏，呼吸困难，摄食减少，精神萎靡，活动度下降等临床表现。在感染后1～5天，用RT-PCR方法可以从鼻甲骨活检物中检测到病毒载量。从雪貂的鼻甲骨标本、肺组织标本中，经MDCK细胞培养，产生了典型的细胞病变(CPE)，提示病毒感染了雪貂并有病毒的复制和排毒。病毒在雪貂肺组织以外的组织器官中复制、繁殖，在脑、心、肝、脾、肠、肾、淋巴结组织中分离到活病毒。在感染H5N1后，静脉采血1ml分离血清，检测血清中的H5N1病毒特异性抗体，检测结果不能为阳性。最终，解剖大体观察发现肺组织存在明显炎症及水肿等表现，镜检可见肺泡腔内的明显炎性渗出物。肺间隔广泛增宽伴大量单核细胞为主的炎细胞浸润，肺泡受压变形变小，并有局限性肺泡间隔增宽后相互融合，部分区域有大片状肺泡间隔增宽后相互融合。肺泡间隔内有淋巴细胞、浆细胞以及吞噬细胞，病变范围广泛，呈中重度间质性肺炎。

北检院部分仪器展示