1. HBV转基因模型制作方法一

(1) 复制方法：利用转基因技术，制作HBV病毒转基因小鼠模型。该模型可分为HBV部分片段及HBV全长或超长序列几种模型。

为了增加模型的稳定性，建议使用HBV全长或超长序列的模型。

(2) 模型特点：HBV转基因小鼠对HBV免疫耐受，不会引发免疫清除作用，因此可以观察HBV对肝细胞的直接损害。值得注意的是，含外源启动子的HBsAg转基因小鼠(50-4)会产生大量HBsAg的大包膜蛋白，使HBsAg在肝细胞内质网内积聚，并且不能有效地分泌，导致肝细胞出现毛玻璃样改变，从而受到损伤。

此外，HBV标志物主要出现在肝脏，但也可在肾、胰等脏器及外周血中表达。全长1096bp 1.3拷贝HBV转基因小鼠的血清水平可达到3×10000000～9×10000000基因组当量/ml，相当于人慢性HBV感染者的水平，同时血中可以测出HBsAg、前S1和HBeAg。因此，该模型是一种较好的药物筛选模型。

(3) 比较医学：建立HBV转基因小鼠模型对加强HBV分子生物学、免疫学研究非常有意义，尤其是加强HBV感染肝细胞的分子机制研究。

2. HBV转基因模型制作方法二

(1) 复制方法：选取6～8周龄BALB/cJ小鼠，采用高压水注射方法，通过尾静脉将具有复制能力的HBV质粒导入小鼠体内，每只动物给予15μg HBV质粒，加入总体积为0.1ml/g体重的复方氯化钠溶液，5～7s内尾静脉注射进入小鼠体内。然后，通过real-time PCR、ELISA、Southern Blot、Northern Blot以及免疫组化等方法，检测小鼠病毒血症、血清和肝组织中HBV抗原表达动态变化，肝组织中HBV转录和复制情况，以及免疫应答状况。

(2) 模型特点：在注射后24小时内，HBV质粒就可到达肝细胞，并在这些细胞内大量转录。病毒RNA很快翻译成蛋白质，导致高水平的HBsAg血症及HBeAg血症的产生，同时也出现了病毒血症。注射后24小时开始，肝细胞内HBcAg表达阳性细胞达到5％。第2～4日，循环HBsAg及HBeAg水平下降；第7日循环HBsAg及HBeAg水平急剧下降，此时血清中出现相应的抗体。在注射后第4日，小鼠的脾脏开始增大，第7～10日最明显，然后开始回缩。同时，肝细胞出现淋巴细胞浸润。CD3/CD8阳性细胞数量于注射后第4日开始增加，而HBcAg阳性肝细胞数量在注射后第7～10日急剧减少，与肝内炎症细胞浸润、病毒RNA和复制中间体的减少相关，同时伴随着轻微的血清ALT水平升高。到注射后第20日，肝脏的病毒标志全部消失。

(3) 比较医学：HBV感染后宿主和病毒相互作用的各个方面都可以在这种免疫背景清楚的纯系小动物中复制出来。该方法建立的模型为HBV的研究提供了一种新的途径，特别是HBV病毒学和免疫学的详细研究。只要构建各种已知的HBV变异基因组，就可以在免疫幼稚或正常小鼠体内，也可以在现有的各种转基因小鼠体内研究其生物学特性。同时，该模型不仅适用于HBV研究，也适用于研究其他肝脏特异性病原，对于具有肝内复制潜能的新现病毒的研究也具有特别的意义。

北检院部分仪器展示