技术概述
水中细菌多管发酵法试验是一种经典的水质微生物检测方法，主要用于检测水样中总大肠菌群、耐热大肠菌群（粪大肠菌群）和大肠埃希氏菌等指示微生物。该方法基于统计学原理，通过多个稀释度的水样接种于特定培养基中，根据产酸产气反应判断阳性结果，最终利用最可能数（MPN）表查得每100mL水样中待测菌的数量。
多管发酵法又称MPN法或最大可能数法，其核心原理是将水样进行系列稀释后，分别接种于含有乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，在特定温度下培养一定时间后，观察细菌生长情况。若发酵管内出现产酸产气现象，则表明该管中有目标菌存在。通过对各稀释度阳性管数的统计，结合MPN检索表，可以计算出原水样中目标细菌的浓度。
该方法具有灵敏度高、可检测低浓度细菌样本、操作相对简便等优点，是目前国内外水质卫生标准中广泛采用的微生物检测方法之一。在我国《生活饮用水标准检验方法》（GB/T 5750）和《水和废水监测分析方法》等标准中，多管发酵法被明确规定为水质微生物检测的标准方法。
多管发酵法根据检测目的和培养条件的不同，可分为初发酵试验、复发酵试验和确证试验三个阶段。初发酵试验用于初步筛选可能含有目标菌的水样，复发酵试验用于排除假阳性结果，确证试验则进一步确认目标菌的存在。通过这一系列严谨的试验流程，可以准确可靠地获得水中细菌的定量数据。
检测样品
水中细菌多管发酵法试验适用于多种类型的水样检测，涵盖生活饮用水、水源水、废水、再生水等多个领域。不同类型的水样在采集、保存和预处理方面有着不同的要求，以确保检测结果的准确性和代表性。
- 生活饮用水：包括自来水厂出厂水、管网水、二次供水、瓶装饮用水等
- 水源水：地表水如河流、湖泊、水库水，地下水如井水、泉水等
- 废水：生活污水、工业废水、医院污水等
- 再生水：经过处理后的回用水，如中水、景观用水等
- 游泳池水：游泳池、温泉池、水上乐园等场所用水
- 食品工业用水：食品加工用水、饮料生产用水等
- 医疗用水：透析用水、注射用水、制剂用水等
- 养殖用水：水产养殖用水、畜禽饮用水等
水样采集应使用无菌玻璃瓶或聚丙烯塑料瓶，采样前应对容器进行严格灭菌处理。采样时应避免外界污染，采集后应在2小时内进行检测，如不能及时检测，应置于4℃环境下保存，但保存时间不应超过24小时。对于含有余氯的水样，采样瓶中应预先加入硫代硫酸钠以中和余氯的杀菌作用。
水样采集量应根据预计的细菌浓度确定，一般生活饮用水采集100mL以上，污染较重的水样可适当减少采集量或进行稀释。采样时应详细记录采样地点、时间、水温、pH值、余氯含量等信息，为后续检测和结果分析提供参考依据。
检测项目
水中细菌多管发酵法试验主要针对水中的指示性微生物进行检测，这些指标能够反映水体受污染的程度和潜在的健康风险。以下是该方法可检测的主要项目：
- 总大肠菌群：指在37℃培养24-48小时能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，是评价水体受粪便污染程度的重要指标
- 耐热大肠菌群（粪大肠菌群）：指在44.5℃仍能生长繁殖发酵乳糖产酸产气的大肠菌群，更能准确反映粪便污染情况
- 大肠埃希氏菌：俗称大肠杆菌，是人和温血动物肠道内的正常菌群，其存在表明水体可能受到近期粪便污染
- 沙门氏菌：重要的肠道致病菌，可引起伤寒、副伤寒和食物中毒等疾病
- 志贺氏菌：引起细菌性痢疾的病原菌
- 铜绿假单胞菌：条件致病菌，可引起皮肤感染、中耳炎等
其中，总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌是最常用的水质卫生指标。根据我国《生活饮用水卫生标准》（GB 5749）规定，生活饮用水中总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌均不得检出（MPN/100mL或CFU/100mL为0）。
在检测过程中，应根据检测目的和水质标准要求，选择合适的检测项目。对于常规水质监测，一般只检测总大肠菌群；对于水源水或污染较重的水样，可能需要同时检测多个指标；对于食品工业用水或医疗用水，可能还需要增加特定致病菌的检测。
检测方法
水中细菌多管发酵法试验的标准操作流程包括多个关键步骤，每个步骤都需要严格按照规范操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。以下是根据国家标准方法整理的详细操作流程：
首先进行水样稀释。根据预计的细菌浓度，将水样进行适当的系列稀释。对于清洁的生活饮用水，通常不稀释或仅进行低倍稀释；对于污染较重的水样，需要进行10倍系列稀释，制备10⁻¹、10⁻²、10⁻³等稀释度的水样。稀释液一般使用无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液。
初发酵试验是多管发酵法的第一阶段。选用适当数量的发酵管（常用15管或18管法），每管加入乳糖蛋白胨培养基，灭菌后冷却备用。将不同稀释度的水样分别接种于发酵管中，每稀释度接种若干管，每管接种一定体积的水样（通常为10mL或1mL）。将接种后的发酵管置于37℃恒温培养箱中培养24±2小时。
培养后观察各发酵管的变化。若发酵管内培养液变黄（产酸）且杜汉氏小管内有气泡（产气），则判为阳性；若仅有产酸而无产气，或无任何变化，则判为阴性。记录各稀释度的阳性管数，准备进行下一步试验。
复发酵试验是对初发酵阳性管的进一步确认。从初发酵阳性管中取样，接种于含煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）的发酵管中，在37℃下培养24±2小时。观察产酸产气情况，有产酸产气者判为阳性，证实存在总大肠菌群。
耐热大肠菌群检测需在44.5℃条件下进行复发酵试验。将初发酵阳性管中的培养物转种于EC肉汤中，置于44.5℃水浴或培养箱中培养24小时，观察产气情况。产气者表示存在耐热大肠菌群。
大肠埃希氏菌的确证试验可采用EC-MUG法或NA-MUG法。将耐热大肠菌群阳性培养物接种于含MUG（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷）的培养基中，培养后在紫外光下观察荧光反应。产生蓝色荧光者表明存在大肠埃希氏菌。
结果计算时，根据各稀释度的阳性管数，查阅相应的MPN检索表，得到每100mL水样中目标菌的最可能数。MPN值是一个统计估计值，反映了水样中目标菌浓度的置信区间。
整个检测过程应设置空白对照、阳性对照和阴性对照，以验证培养基的有效性和检测过程的可靠性。空白对照用以检查操作过程中是否存在污染，阳性对照用以验证培养基是否支持目标菌生长，阴性对照用以验证培养基的选择性。
检测仪器
水中细菌多管发酵法试验需要多种专业仪器设备，这些设备的性能和状态直接影响检测结果的准确性。检测机构应配备齐全的仪器设备，并定期进行检定、校准和维护，确保仪器处于良好工作状态。
培养设备是多管发酵法试验的核心仪器。主要包括：电热恒温培养箱，用于37℃和44.5℃的培养，温度控制精度应在±0.5℃以内；隔水式恒温培养箱或电热恒温培养箱，用于耐热大肠菌群检测时维持44.5℃的精确温度；恒温水浴锅，用于需要精确控温的培养过程。
灭菌设备是保证无菌操作的基础。高压蒸汽灭菌器是最常用的灭菌设备，能够在121℃、103.4kPa条件下有效杀灭微生物；干热灭菌器用于玻璃器皿的灭菌；紫外灭菌灯用于超净工作台或无菌室的空气消毒。
显微镜及配套设备用于细菌形态学观察。生物显微镜是基本配置，观察细菌形态、染色反应和运动性；相差显微镜可观察活菌的形态和运动；荧光显微镜用于MUG法检测大肠埃希氏菌时的荧光观察。
常规检测设备包括：超净工作台或生物安全柜，提供无菌操作环境；电热恒温干燥箱，用于器皿烘干和干热灭菌；冰箱和冷藏柜，用于培养基和试剂的保存；电子天平，感量至少为0.1mg，用于培养基和试剂的称量；pH计，用于培养基pH值的测定和调节。
玻璃器皿是微生物检测的必备耗材，包括：试管、发酵管、杜汉氏小管、培养皿、三角瓶、量筒、移液管等。这些器皿应选用硬质玻璃材质，耐高温高压，透明度好，便于观察培养结果。
其他辅助设备包括：菌落计数器，便于菌落计数；电动移液器，提高移液效率和准确性；恒温摇床，用于液体培养基的振荡培养；超声波清洗器，用于玻璃器皿的清洗等。
所有仪器设备应建立设备档案，记录购置、验收、使用、维护、检定、校准等信息。使用前应检查仪器状态，确保正常运行。对于需要检定或校准的仪器，应按照规定的周期进行检定校准，并在有效期内使用。
应用领域
水中细菌多管发酵法试验在多个行业和领域有着广泛的应用，为水质安全评价提供重要的技术支撑。以下是该方法的典型应用领域：
饮用水卫生监测是多管发酵法最重要的应用领域之一。自来水厂需要对出厂水、管网水进行常规检测，确保水质符合国家标准要求。卫生监督部门定期对生活饮用水进行抽检，保障居民饮水安全。农村饮水安全工程、二次供水设施也需要进行微生物指标检测。
环境保护领域广泛应用该方法进行水质监测。环境监测部门对地表水、地下水进行定期监测，评价水环境质量状况。污水处理厂需要对进出水进行检测，评估处理效果和排放达标情况。环境影响评价、污染源调查等工作中也需要进行水质微生物检测。
食品加工行业对生产用水有严格要求。饮料、瓶装水、乳制品等食品生产企业需要定期对生产用水进行检测，确保产品卫生安全。食品加工设备和容器的清洗消毒效果也需要通过微生物检测进行评价。
医疗卫生领域是该方法的重要应用场景。医院感染控制需要对医疗用水进行检测，包括透析用水、口腔诊疗用水、内镜清洗用水等。疾病预防控制机构在对水源性疾病进行调查处置时，需要进行水质微生物检测。
游泳场所和水上乐园需要定期对池水进行检测，确保水质卫生达标。酒店、宾馆等公共场所的生活饮用水也需要进行常规监测。学校和幼儿园的饮水安全监测同样采用该方法。
畜牧业和水产养殖业对养殖用水有特定要求。畜禽饮用水需要符合卫生标准，水产养殖用水的卫生状况直接影响养殖产品的质量安全。多管发酵法在这些领域的水质监测中发挥着重要作用。
建筑工程领域在竣工验收时需要对供水系统进行水质检测。新建住宅小区、办公楼、商场等建筑的供水设施在投入使用前，必须进行水质检测并取得合格报告。二次供水设施的改造和维护也需要进行水质检测。
常见问题
在水样采集过程中，采样容器是否需要添加保护剂？对于含有余氯的水样，采样瓶中应预先加入硫代硫酸钠溶液，以中和余氯的杀菌作用，防止水样中细菌在运输保存过程中死亡。一般每500mL采样瓶加入1.5%硫代硫酸钠溶液0.5mL，可中和约5mg/L的余氯。对于不含余氯的水样，则不需要添加保护剂。
水样采集后可以保存多长时间？水样采集后应尽快进行检测，最好在2小时内进行。如不能及时检测，应置于4℃冰箱中保存，保存时间一般不超过24小时。冷冻保存会破坏细菌细胞结构，不适用于细菌检测的水样保存。运输过程中应避免阳光直射和剧烈振动。
多管发酵法和滤膜法有什么区别？两种方法都是检测水中大肠菌群的标准方法，但原理和适用范围不同。多管发酵法基于统计原理，通过系列稀释和阳性管数查表得到结果，适用于各种类型的水样，特别是浑浊度高或含悬浮颗粒多的水样。滤膜法则通过过滤一定体积水样，将细菌截留在滤膜上培养计数，适用于较清洁的水样，可得到实际的菌落数。两种方法的检测精度和适用条件不同，应根据实际情况选择。
MPN值的含义是什么？MPN是Most Probable Number的缩写，即最大可能数或最可能数。MPN值是一个统计学估计值，表示在一定置信水平下，水样中目标菌浓度的估计值。MPN值不是实际菌落数，而是一个概率估计值，通常附有95%置信区间。MPN值越高，表示水样受污染程度越严重。
如何判断检测结果是阳性还是阴性？多管发酵法的判断主要依据产酸产气反应。初发酵试验中，若培养液变黄（产酸）且杜汉氏小管内有气泡（产气），判为阳性；仅有产酸或仅产少量气体时，需继续培养观察或进行确证试验。复发酵试验中，BGLB培养基产气判为阳性。耐热大肠菌群检测中，EC培养基在44.5℃条件下产气判为阳性。
为什么有时候会出现假阳性结果？假阳性结果可能由多种原因导致。某些非目标菌如产气荚膜梭菌、某些芽孢杆菌在特定条件下也能发酵乳糖产酸产气。培养基配制不当、培养条件不适宜、操作过程中污染等都可能导致假阳性。通过复发酵试验和确证试验，可以排除大部分假阳性结果。
检测结果超标时应该怎么处理？当检测结果显示水中细菌指标超标时，应首先核实检测过程是否规范，必要时进行复检确认。确认超标后，应及时通知委托方和相关部门。对于供水单位，应立即查找污染源，采取消毒、冲洗管网等措施，消除污染隐患。处理完成后应进行复检，确保水质达标后方可恢复供水。
多管发酵法的检测结果重复性如何？多管发酵法基于统计原理，不同次检测结果之间存在一定变异是正常的。对于同一水样进行多次检测，MPN值可能有所不同，但一般应在合理的置信区间范围内。提高检测重复性的方法包括：严格按照标准方法操作、使用高质量的培养基和试剂、保持培养条件的稳定性、规范操作技术等。
