本文主要介绍了基因敲除细胞中常见的问题——蛋白残留。在验证基因敲除是否成功时，Western Blot是一个重要的方法。然而，在实验过程中，偶尔会出现测序鉴定为KO纯合子但WB实验却有条带的情况，即蛋白残留。
那么基因敲除细胞时蛋白残留是如何产生呢？
1.由于目的基因的多转录本引起的蛋白残留。 基因一般含有多个不同的转录本，在选择敲除位点时，很难覆盖所有的转录本，未被影响到的转录本就有可能正常转录翻译从而表达出具有部分功能域的蛋白。因此，设计KO细胞方案时应尽可能覆盖多个转录本。
2.由于基因的可变剪切引起的蛋白残留。 可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制。当我们构建KO细胞时，敲除位点处外显子被切割后，缺失的外显子序列在RNA剪切阶段被略过，直接将其上游的外显子与下游的外显子相连，形成一种全新的mRNA，从而继续蛋白的翻译。
3.外因——Western Blot抗体的选择。 Western Blot检测技术是基于抗原抗体的特异性结合的原理，抗体的特异性决定了它能否与目的蛋白结合。若抗体与蛋白的结合区域若存在于敲除位点之前，就可能会出现抗体与N端残留蛋白的结合，从而导致Westen Blot检测条带的出现。
我们该如何规避蛋白残留风险？
首先，gRNA的设计决定了切割位点的位置，因此gRNA的设计通常也是避免蛋白残留问题的关键。设计多条gRNA并在cell pool阶段根据切割效率的高低选择最佳gRNA。
其次，在设计KO细胞方案时，综合多个数据库的设计结果、参考相关的文献报道并结合常用抗体信息的分析，并根据实际情况进行阶段性的WB测试，从而实现所建立的KO细胞无蛋白残留。
最后，对于长度较短、又无法找到合适切割位点的基因，我们也可采取大片段敲除或全敲的策略，确保得到的纯合子细胞蛋白不残留。
