霍乱菌动物模型

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霍乱弧菌感染模型被广泛应用于疾病研究。2007年,Olivier等人使用5周龄C57BL/6小鼠建立了可靠的霍乱弧菌感染模型。该模型使用链霉素抗性的菌株,在小鼠体内引发感染,为研究霍乱弧菌的发病机理提供了有力的支持。

一、霍乱弧菌菌株

在该实验中,使用链霉素抗性的霍乱弧菌。将霍乱弧菌的培养物用含有100mg/ml链霉素的LB培养基稀释,然后在30℃培养至对数中期,或者OD600达到0.5左右。收集细菌,用PBS洗涤两次,得到菌悬液。

二、感染方法

将4~5周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠(也可使用BABL/c小鼠)自由饮用链霉素溶液(1mg/ml)4~7天,并在感染前一天禁食,但不禁水。在感染操作时,小鼠腹腔注射氯胺酮(60~70mg/kg体重)和甲苯噻嗪(12.5mg/kg)麻醉,随后用50μl的8.5%的碳酸氢钠灌胃并立即用22G的灌胃针在胃中注入50μl的霍乱弧菌悬浮液。

三、病原检测

将小鼠感染后的小肠、盲肠和大肠采集下来,将小肠切为近端、中端和远端三段,然后将所有的器官在PBS中匀浆。梯度稀释后涂布到LB平板上培养,从而得到菌落并计算菌落数。

四、模型鉴定

在该模型中,小鼠感染后1小时内,霍乱弧菌即可到达小肠的近端,3小时后到达小肠的中端,6小时后到达小肠的远端。在感染后的3~6小时内,小肠的中端和远端的霍乱弧菌数量达到高峰,超过感染剂量,并在感染后12小时达到复制的最高峰。随后,小肠内的霍乱弧菌数量开始降低,数目达到接种量的千分之一,并在72小时内维持稳定。

在该模型中,使用10的8次方的感染剂量可达到100%的致死率,小鼠感染后24小时内便开始死亡。当感染剂量降低时,小肠内的细菌在12小时内便被清除完全,而盲肠与大肠中的细菌在72小时内被清除完全。

在感染后12小时,使用10的7次方cfu野生型V.cholerae感染小鼠(非致死量),可导致严重的组织坏死。进行病理HE染色可观察到感染小鼠末端小肠腔内坏死细胞沉积,如下图所示:

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