鼠疫的小鼠感染模型制作方法

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(1)实验菌株和实验动物:本实验选用军事医学科学院分析微生物室提供的鼠疫菌201菌株,对小白鼠有强毒性,对人不致病。实验动物采用雌性BALB/c 小鼠,年龄6-8周,所有实验操作均在生物安全三级实验室内进行。

(2)菌液制备:在赫氏琼脂培养基中接种鼠疫菌201菌株,28℃下培养24h,通过接种环刮取菌苔,悬浮于3ml生理盐水中,制备鼠疫菌菌液,并使用生理盐水进行10倍系列稀释。通过100μl涂布于平板上并进行活菌计数,同时涂布较高浓度的菌液进行噬菌体裂解实验。

(3)动物感染:注射剂量为0.2ml 0.4%戊巴比妥钠使雌性BALB/c小鼠达到中度麻醉状态,每侧鼻孔滴入5μl浓度为4×10^8cfu/ml的鼠疫菌菌液。观察小鼠的存活率作为感染效果评估指标。

(4)鼠疫菌体内载量实验:通过感染后不同时间点(4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h)对5只小鼠的肺、肝、脾进行眼球取血后处死并去肺、肝、脾等组织。使用玻璃匀浆器(200℃烘烤24 h后使用)制成匀浆,并进行适当稀释,使用问题溶液进行涂布和细菌计数。观察感染后小鼠不同组织内的鼠疫菌数目动力学变化。

(5)病理学观察:在感染后不同时间点(每组5只)去除小鼠的左下、右上肺、一半肝和脾以及心、肾、胰腺、胸腺和肠系膜淋巴结组织,使用10%中性福尔马林溶液固定小鼠组织,然后进行石蜡包埋并制成薄切片,使用苏木素-伊红(HE)染色后使用光学显微镜观察组织病理学改变。在感染后不同时间点(每组5只)采集肺、肝、脾组织制成2-3mm厚的组织块,使用4℃预冷的3%戊二醛进行固定,然后使用1%锇酸固定,使用乙醇-丙酮脱水环氧树脂包埋,并制作超薄切片,醋酸铀-枸橼酸铝双重染色后使用PHLIPS MegaViewⅡ型透射电子显微镜观察组织超微结构的变化。

(6)模型结果: 在本实验中,小鼠经过鼻内感染鼠疫菌4小时后可播散进入血液和其他器官。血液、肺和脾内的鼠疫菌cfu数量在攻击后第8h之内出现了最小值,而肝脏则是在第12h内,这些结果表明宿主防御系统在感染早期发挥着极其重要的作用。与血液和脾相比,肝对于鼠疫菌的清除能力相对较弱。肺内鼠疫菌cfu数量在第8小时到第36小时之间呈快速增长,在第36小时达到了10的7次方,并进入稳定的生长状态。脾内鼠疫菌cfu数量的动力学变化与血液相似,但在攻击后第8h脾可以完全清除鼠疫菌,说明

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