1.基因工程小鼠模型在研究普朊病毒病方面起着重要作用。目前，主要的研究手段包括PRNP基因敲除小鼠和表达外源PRNP基因小鼠。

(1)PRNP基因敲除小鼠：基因敲除是一种新型分子生物学技术，通过替换特定基因片段以实现基因失活或缺失的技术。PRNP基因敲除小鼠可以通过先从小鼠胚胎干细胞中导入重组载体，再进行同源重组来实现。现有的五种PRNP基因敲除小鼠均采用该方法进行构建，其中Prnp -/-[ZürichⅡ]小鼠的制备方法如下图所示。

具体制备方法是：利用骨架载体pBS-KS，插入包含小鼠PRNP第三个外显子及上游1.4kb、下游3.7 kb DNA序列的载体，并在外显子前同时插入两个筛选基因HSV-tk和neo。然后，将三个loxp序列分别插入在HSV-tk基因前、neo基因后和Prnp外显子后，构造出PRNP lox3替换载体。接着，将替换载体线性化后用电穿孔方法转入培养的小鼠胚胎干细胞。转化后进行筛选和PCR鉴定形成的细胞克隆，最后使用Southern blot鉴定基因组是否与替换载体发生同源重组。为了将PRNP外显子剪切，向阳性细胞克隆中转入表达Cre质粒，使用外源Cre可使三个loxp位点中的两个位点随机剪切后连接。最终，将阳性细胞克隆利用显微操作的方法注射入C57BL/6小鼠囊胚期胚胎腔内，成功剪切掉所有筛选标记基因和Prnp第三个外显子基因的小鼠即为Prnp -/-[ZürichⅡ]所得。

(2)表达外源PRNP基因小鼠：采用显微注射法可以从外源导入基因，该方法具有操作简单的优点。显微注射法通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵中，从而实现外源基因整合到受体细胞染色体上，发展出新的转基因动物技术。该方法的优点是外源基因的导入整合效率较高，可以把不同长度的重组DNA片段注入原核，不需要载体，直接转移目的基因。它可以直接获得纯系，实验周期短。然而，该方法的主要缺点是外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重者可能导致死亡。目前已有成功的表达外源PRNP基因的小鼠模型，如表13-4所示。

(3)常用PRNP转基因载体：目前有两种载体常用于PRNP转基因小鼠的构建，即PrP cosmid和half-genomic PrP vector。40kb小鼠粘粒I/InJ来自于鼠Prnp b等位基因，包括6kb启动子、三个外显子和两个内含子、以及包括Prnd基因的3'下游18kb序列。然而，该粘粒过大并不利于实验操作，随后又构建了来自于鼠的Prnp a等位基因，包括启动子序列、三个外显子和第一个内含子、以及3'下游2.2bp序列的half-genomic PrP vector，这个质粒不包括Prnd基因。

北检院部分仪器展示