在条件性基因敲入(conditional knockin)小鼠中，通常会在启动子后插入LoxP介导的终止子，来实现条件性基因敲入。这个终止子设计为在敲入基因编码区的上游、启动子末端下游，具有两端带有LoxP元件的结构。这样的基因敲入小鼠中，目的基因表达完全受到终止子的抑制，直到Cre重组酶出现将终止子剔除后才能正常表达。因此，只需要通过控制Cre重组酶的时空特异性表达，就能在合适时间地点启动敲入基因的表达。

对于点突变敲入实验，与条件性基因敲入类似，只要同时把LoxP介导的终止子和点突变基因通过传统同源重组打靶ES细胞，生产基因敲入小鼠，然后根据实验需要与条件性表达Cre的转基因小鼠杂交，即可实现条件性敲入点突变小鼠模型的构建。在近年来的针对浸润性导管胰腺癌的研究中，研究人员使用条件性基因敲入的方式获得了KrasG12D点突变敲入且以LoxP-stop codon控制表达的小鼠。只有在这类小鼠与以Pdxl启动子特异性控制Cre重组酶的转基因小鼠杂交产生的后代中，才会发生胰腺癌变。

除了Cre/LoxP重组系统外，还有许多类似的重组酶系统，比如Flp/Frt重组酶系统。但由于Flp重组酶的最适作用温度是30℃，不如Cre适应性强（最佳温度为37℃），这就限制了Flp在哺乳动物体内的实用性。但我们依然可以在细胞水平上使用Flp/Frt重组体系，从而实现可以将两种重组系统结合的两步法条件性基因敲入和敲除。这与传统的3个LoxP组成的小鼠相比，有效提高了后期杂交后代阳性的几率。最近，突变型优化的Flp酶可以有效地在37℃工作，为基因修饰动物提供了很有用的工具（见图3-14）。

图3-14 FLP和Cre技术结合的基因敲除技术

随着RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术的发展，研究者开始利用基因敲入生产RNAi小鼠。但由于全身范围内的基因敲低（knockdown）对于科学研究来说是难以接受的，人们开始寻求Cre/LoxP介导的条件性RNAi。研究者在RNAi载体的shRNA正反义链间插入floxed-stop codon，然后通过基因敲入导入ROSA26位点，通过特异性表达的Cre重组酶控制RNAi的组织特异性。此外，还可以向shRNA启动子区插入正筛选基因（如flox PGK-neo）来阻止shRNA转录的方式实现Cre/LoxP特异性调控shRNA基因敲入小鼠的基因表达。

北检院部分仪器展示