制作基因敲除小鼠需要经过以下几个步骤：

（一）基因打靶载体的构建

基因打靶载体的中心是正筛选基因及相关序列，左右两侧各为长短同源臂和负筛选基因。同源臂的长度适中为佳，一般采用一长一短的设计方式。打靶载体的构建需要考虑目标位点和打靶基因周围序列。

（二）ES细胞基因打靶和中靶克隆的筛选

ES细胞主要来源于129、C57BL/6和BALB/c背景的小鼠。将DNA片段通过诸如电转染和核转染等方式导入细胞，再利用同源臂进行同源重组。同源重组的产物需要通过PCR反应进行筛选，阳性克隆还需要进一步通过Southern blotting分析进行验证。确定后，将中靶细胞显微注射到胚胎囊胚期胚胎中。再将囊胚移植到假孕母鼠体内，产生嵌合小鼠。

（三）ES细胞克隆的胚胎显微注射和胚眙移植

筛选得到的中靶细胞通过显微注射的方式注入到胚胎囊胚期胚胎的囊胚腔中，然后将囊胚移植到如假孕母鼠体内，从而产生子代嵌合小鼠。

（四）基因敲除小鼠培育

嵌合小鼠需要与野生型小鼠交配，以实现基因修饰生殖系传递。子代中出现毛色分离，如ES细胞来源129小鼠，其中带129品系背景毛色的为所需小鼠，大约50％的小鼠应该带有修饰的基因。如ES细胞未能成功嵌合进入生殖细胞中，则该基因修饰不可遗传。基因敲除小鼠需要通过培育数代自交获得纯合、可遗传的后代，然后用于不同的研究中。

基因敲除小鼠制作的基本流程如图3-8所示。

图3-8  基因敲除小鼠制作的基本流程示意图

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