技术概述
β-羟基丁酰化修饰是一种近年来被发现的重要蛋白质翻译后修饰类型，主要发生在组蛋白及非组蛋白的赖氨酸残基上。该修饰由体内重要的酮体分子D-β-羟基丁酸诱导产生，其本质是在赖氨酸的ε-氨基上共价连接一个β-羟基丁酰基团，在质谱检测中表现为约86 Da的质量偏移。2016年，研究人员首次在饥饿小鼠肝脏组织中系统鉴定到该修饰，并证实其与机体能量代谢状态密切相关，自此β-羟基丁酰化修饰逐渐成为表观遗传学与代谢交叉领域的研究热点。
在饥饿、高强度运动、生酮饮食、糖尿病等生理或病理状态下，机体酮体水平显著升高，β-羟基丁酰化修饰水平也随之发生动态变化。研究表明，该修饰不仅能够调控组蛋白的结构与基因转录活性，还广泛分布于代谢酶等非组蛋白上，参与糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢等多种代谢通路的精细调控，与肿瘤、神经退行性疾病、炎症反应以及衰老过程等密切相关。
β-羟基丁酰化修饰相对定量分析是指在不同生理或处理条件下，对蛋白质上发生该修饰的位点及修饰水平进行大规模鉴定与相对丰度比较的蛋白质组学研究手段。其技术核心在于利用泛β-羟基丁酰化修饰抗体对酶切后的修饰肽段进行免疫亲和富集，结合高分辨质谱进行检测，再通过标记定量或非标记定量策略实现修饰位点在不同样品间的相对定量比较，并借助生物信息学分析揭示修饰变化背后的生物学意义，为阐述代谢调控机制与疾病发生发展机理提供数据支撑。
检测样品
β-羟基丁酰化修饰相对定量分析适用于多种类型的生物样品，常见送样类型如下：
- 动物组织样品：肝脏、脑、心脏、肾脏、骨骼肌、脂肪组织等；
- 细胞样品：贴壁细胞、悬浮细胞、原代细胞、药物处理细胞等；
- 植物样品：叶片、根、种子、愈伤组织等；
- 微生物样品：细菌、真菌、酵母菌菌体等；
- 临床样品：手术或穿刺获取的病变组织及配对癌旁组织等；
- 体液样品：血清、血浆等（需提前评估修饰丰度与送样量）。
由于β-羟基丁酰化修饰丰度相对较低，属于低丰度翻译后修饰，建议送样时保证充足的总蛋白量，以确保富集效果与鉴定深度。所有样品采集后应迅速置于液氮或干冰中速冻，并在低温条件下保存与运输，避免反复冻融导致修饰丢失或蛋白降解。
检测项目
围绕β-羟基丁酰化修饰相对定量分析，可开展的检测与分析项目主要包括：
- β-羟基丁酰化修饰位点的大规模鉴定；
- 修饰位点水平的相对定量分析，比较不同组别间每个修饰位点的丰度变化；
- 修饰蛋白质水平的相对定量分析；
- 差异修饰位点与差异修饰蛋白的筛选；
- 修饰蛋白的基因本体（GO）功能富集分析；
- 修饰蛋白的KEGG代谢通路富集分析；
- 修饰位点周围motif序列特征分析；
- 蛋白质互作网络分析与亚细胞定位分析；
- 个性化生物信息学深度挖掘与多组学联合分析。
检测方法
β-羟基丁酰化修饰相对定量分析采用免疫亲和富集结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的策略，整体实验流程如下：
- 样品制备与蛋白提取：将样品在含变性剂、蛋白酶抑制剂与去乙酰化酶抑制剂的裂解液中充分匀浆裂解，提取总蛋白质；
- 蛋白定量与酶解：采用BCA或Bradford法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行还原与烷基化处理，选用胰蛋白酶酶解过夜，将蛋白降解为肽段；
- 标记定量（可选）：采用TMT/iTRAQ等标记技术时，对各组分肽段分别标记后等量混合，实现多组样品的同时定量比较，亦可选择Label-free非标记定量策略；
- 色谱分级：对肽段进行高pH反相色谱分级，降低样品复杂度，提高修饰肽段的检出率；
- 免疫亲和富集：采用高特异性泛β-羟基丁酰化修饰抗体对修饰肽段进行富集，显著提升低丰度修饰肽段的检测灵敏度；
- 液质联用检测：富集后的修饰肽段经纳升液相色谱分离，进入高分辨率串联质谱进行数据采集（DDA或DIA模式）；
- 数据库检索与定量：使用专业搜库软件检索数据库，以赖氨酸+86.0368 Da为可变修饰进行位点定位，结合标记报告离子强度或母离子峰面积完成相对定量；
- 生物信息学分析：对差异修饰位点与差异修饰蛋白进行功能富集、motif与网络分析，输出完整结果报告。
整个流程设置生物学重复、空白对照与质控样品，通过多重手段保障定性定位的准确性与定量结果的可靠性。
检测仪器
本项目依托高分辨率质谱平台完成数据采集，主要仪器设备包括：
- Orbitrap系列高分辨质谱仪（如Q Exactive HF-X、Orbitrap Exploris 480）；
- timsTOF Pro系列离子淌度质谱仪；
- Q-TOF高分辨率质谱仪；
- 纳升液相色谱系统（nano-LC）；
- 高pH反相高效液相色谱仪（HPLC）；
- 酶标仪、蛋白电泳与转膜系统等辅助设备；
- 专业生物信息学分析计算平台。
高分辨率质谱能够在毫道尔级别精确测定肽段质量，配合高质量二级碎片离子图谱实现修饰位点的精准定位，为相对定量结果的准确性提供坚实的硬件保障。
应用领域
- 代谢性疾病研究：糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝等疾病中酮体代谢与蛋白修饰调控机制研究；
- 肿瘤研究：肿瘤细胞代谢重编程过程中β-羟基丁酰化修饰的调控作用解析；
- 神经科学研究：生酮饮食干预、神经退行性疾病与酮体信号之间的关联探索；
- 运动科学研究：运动诱导酮体升高引发的蛋白修饰变化与运动适应机制研究；
- 衰老与寿命研究：热量限制、禁食等干预方式下的修饰组动态变化分析；
- 植物科学研究：植物逆境胁迫与能量应激状态下的翻译后修饰应答研究；
- 微生物与发酵工程：酮体代谢相关菌株的修饰调控网络解析；
- 药物研发：靶向酮体代谢及修饰相关酶系统的药物评价与作用机制研究。
常见问题
问题一：β-羟基丁酰化修饰相对定量分析的检测周期是多久？
一般情况下，β-羟基丁酰化修饰相对定量分析的检测周期为7-15个工作日。实际周期会受多方面因素影响，包括检测项目数量的多少、送样样品的数量与组别设置、实验方法的复杂程度、生物信息学分析的深度要求等。例如，样品组别较多或需要多轮分级富集时，前处理与上机时间会相应延长；若客户对分析内容有个性化定制需求，周期也会有所变化。如项目时间紧迫，可提前与技术团队沟通，视仪器排期情况安排加急处理，以尽可能缩短交付时间。
问题二：β-羟基丁酰化修饰相对定量分析的检测价格是多少？
β-羟基丁酰化修饰相对定量分析的费用受多种因素综合影响，主要包括检测项目的具体内容、所采用的定量方法（标记定量或非标记定量）、送样样品的数量与分组情况、上机时长与检测周期要求、生物信息学分析的工作量以及是否需要个性化深度数据挖掘等。不同实验方案的复杂程度差异较大，费用也会相应浮动。建议您在送样前与我们取得联系，说明研究目的、样品类型与实验设计，技术团队将据此制定合理的检测方案，并提供针对性的报价服务。
问题三：β-羟基丁酰化修饰相对定量分析测试需要什么资质？
我们旗下拥有CMA和CNAS资质，能力范围覆盖蛋白质组学相关检测的多个领域，能够为科研院所、高校及工业客户提供规范的检测服务。同时，我们组建了由蛋白质组学、分析化学与生物信息学背景人员构成的专业技术团队，核心成员具有多年翻译后修饰组学研究经验，并配备高分辨率质谱仪、纳升液相色谱系统等大型精密仪器设备，从样品前处理、质谱检测到数据分析的全流程均建立了完善的质量控制体系，可为项目的科学性与数据可靠性提供充分保障。
问题四：β-羟基丁酰化修饰相对定量分析对样品有哪些要求？
建议送样时尽量保证充足的总蛋白量，动物组织样品建议提供足量的新鲜或冻存组织，细胞样品建议收集足够数量的细胞，具体送样要求可在实验开始前与技术支持沟通确认。样品采集后应快速冻存并全程干冰运输，避免反复冻融。此外，样品应尽量避免含有高浓度去垢剂、染色剂或其他可能干扰质谱检测的试剂，若前处理过程涉及特殊试剂，请提前告知，以便评估其对检测结果的影响并相应调整实验方案。
问题五：为什么β-羟基丁酰化修饰分析多采用相对定量而非绝对定量？
β-羟基丁酰化修饰属于低丰度翻译后修饰，修饰位点数量庞大且分布在众多蛋白上，目前缺乏覆盖全面的商品化重标肽内标，逐一进行绝对定量在成本与通量上均不现实。相对定量通过比较同一修饰位点在不同样品中的信号强度，即可准确反映修饰水平的变化趋势，满足绝大多数机制研究的需求，具有通量高、覆盖广、性价比好的优势。若个别关键位点需要精确的绝对定量，可在相对定量筛选的基础上，定制合成重标肽段，采用PRM等靶向质谱方法进行验证。
问题六：如何保障修饰位点鉴定的准确性，避免假阳性结果？
实验与数据分析环节均设置了严格的质量控制措施。首先，采用高特异性的泛β-羟基丁酰化修饰抗体进行富集，提高目标肽段占比、降低背景干扰；其次，使用高分辨率质谱采集二级图谱，确保碎片离子的质量精度与图谱质量；在数据库检索过程中对位点定位概率设定阈值，并严格控制在肽段与蛋白水平上的假发现率。对于关键差异位点，还可进一步通过PRM靶向质谱或免疫印迹方法进行独立验证，多层面保障结果的准确性与可重复性。
问题七：项目结束后可以获得哪些结果与数据？
项目交付内容通常包括：原始质谱数据文件、修饰位点鉴定结果表（含肽段序列、修饰位点定位信息及谱图证据等）、相对定量结果表（含各位点在各组样品中的定量值、差异倍数与统计学检验结果）、差异修饰位点与差异修饰蛋白列表、GO与KEGG富集分析结果、motif分析图、蛋白互作网络图等分析图表，以及完整的实验流程说明与分析报告。如客户有进一步的数据挖掘需求或论文图表定制需求，生物信息学团队也可提供个性化的延伸分析服务。
