技术概述
β-羟基丁酰化修饰（Lysine β-hydroxybutyrylation，简称Kbhb）是2016年首次被系统鉴定报道的一种新型蛋白质翻译后修饰，其本质是β-羟基丁酸基团在酰基转移酶（如p300）催化下共价连接到蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基上，产生+86.0368 Da的分子量偏移。去酰基化酶HDAC1和HDAC2可催化该修饰的去除，从而形成完整的可逆调控环路。β-羟基丁酰化修饰的供体底物β-羟基丁酸是人体内含量最丰富的酮体，因此该修饰丰度直接反映机体的酮体代谢状态，在禁食、长时间运动、生酮饮食、糖尿病及某些肿瘤状态下显著上调。
在功能层面，组蛋白β-羟基丁酰化（如H3K9bhb）能够松散染色质结构、激活基因转录，参与饥饿应激下代谢相关基因的表达调控；非组蛋白β-羟基丁酰化则广泛影响代谢酶活性、信号通路转导与蛋白稳定性。近年来，β-羟基丁酰化修饰已成为表观遗传学与代谢交叉研究领域的前沿热点，受到越来越广泛的关注。
β-羟基丁酰化修饰丰度绝对定量测定采用稳定同位素稀释-液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）策略，通过向样品中加入已知量的重同位素标记标准肽段作为内标，结合平行反应监测（PRM）或多反应监测（MRM）靶向扫描模式，对目标修饰肽段进行高灵敏、高特异性检测，经标准曲线或内标校准计算后，直接给出样品中修饰丰度的绝对数值（如fmol/μg总蛋白、fmol/10^6细胞）。该方法不依赖样品间相互比较，结果可直接与文献数据、不同批次实验乃至不同实验室的数据进行横向比对，是修饰水平精确表征的金标准手段。
检测样品
本检测可接收多种类型的生物样品，常见样品类型及推荐送样量如下：
- 动物组织样品：肝脏、脑、心脏、肾脏、骨骼肌、脂肪组织等，建议送样量不低于100 mg；
- 细胞样品：贴壁细胞、悬浮细胞均可，建议细胞量不少于1×10^7个，经PBS清洗后-80℃保存；
- 临床样品：外周血单个核细胞（PBMC）、血小板、手术切除新鲜组织等；
- 植物样品：拟南芥、水稻等模式植物组织；
- 蛋白类样品：总蛋白、酸提取组蛋白、免疫纯化蛋白等，蛋白量建议不低于100 μg；
- 其他特殊样品：线虫、果蝇、斑马鱼等模式生物样品，可提前与技术支持沟通确认。
样品质量是影响定量准确性的关键因素。所有样品应避免反复冻融，采集后迅速液氮速冻并置于-80℃保存，运输过程采用足量干冰维持低温，确保修饰状态不被降解或人工引入。
检测项目
依托靶向质谱平台与成熟的检测方法体系，可提供以下β-羟基丁酰化修饰丰度绝对定量检测项目：
- 组蛋白位点特异性β-羟基丁酰化绝对定量：涵盖H3K9bhb、H4K8bhb、H3K18bhb、H2BK5bhb等经典位点，输出每位点的绝对丰度数值；
- 非组蛋白特定位点β-羟基丁酰化绝对定量：针对客户指定的目标蛋白（如代谢酶、转录因子、信号分子）上的Kbhb位点开展靶向定量；
- 总蛋白β-羟基丁酰化修饰水平定量：采用泛Kbhb抗体结合同位素标记参照体系，评估样品整体修饰水平；
- 修饰化学计量分析：同时定量修饰肽段与其对应未修饰肽段，计算目标位点的修饰占比；
- 方法学验证服务：包括线性范围、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、日内/日间精密度、加标回收率等参数的完整验证；
- 定制化检测方案：针对特殊物种、特殊位点或特殊基质样品，提供方法开发与验证服务。
检测方法
β-羟基丁酰化修饰丰度绝对定量测定的核心流程包括样品前处理、内标掺入、质谱检测与定量计算四大环节，具体如下：
- 样品前处理：组织或细胞样品经裂解提取总蛋白，组蛋白采用酸性抽提法富集；对组蛋白还可进行丙酰化衍生封闭未修饰赖氨酸，提升修饰肽段的色谱保留与质谱响应；
- 蛋白酶解：采用测序级胰蛋白酶（必要时辅以其他蛋白酶）将蛋白酶解为肽段，酶解效率通过肽段回收率监控进行控制；
- 修饰肽段富集：针对低丰度修饰肽段，采用泛Kbhb抗体免疫亲和富集或高pH反相色谱分级策略提高检测灵敏度；
- 内标掺入：在流程中加入已知量的重同位素标记修饰肽段（AQUA内标），内标与目标肽段化学性质一致、质量相差数个道尔顿，可与内源性肽段共洗脱、共离子化；
- 质谱采集：采用PRM模式在高分辨质谱上对目标肽段及其内标进行全碎片离子扫描，或采用MRM模式在三重四极杆质谱上监测特征母离子-子离子对；
- 定量计算：基于目标肽段与内标的峰面积比值，结合标准曲线或单点校准计算绝对含量，最终结果以fmol/μg蛋白、fmol/10^6细胞或pmol/mg组织等形式呈现；
- 数据审核：由专业分析人员使用Skyline等软件进行色谱峰人工核验，剔除干扰峰，确保定量结果可靠。
整个流程设置多层级质控，包括过程空白、混合质控样品、加标回收样品与平行样，全面保障批内批间数据的准确性与可重复性。
检测仪器
本检测依托高分辨质谱与三重四极杆质谱双平台，可根据目标位点的丰度水平与基质复杂度灵活选择最优仪器配置：
- 高分辨液质联用系统：轨道阱高分辨质谱搭配纳升液相系统，具备高质量精度与高分辨率，适用于PRM靶向定量与修饰位点确证；
- 三重四极杆串联质谱：配合超高效液相色谱（UHPLC），可实现MRM模式下的超低检出限定量，适合痕量修饰位点的高灵敏度检测；
- 样品前处理设备：组织研磨仪、超声破碎仪、高速冷冻离心机、真空浓缩仪、固相萃取装置等；
- 配套设备：SDS-PAGE电泳系统、酶标仪、微量分光光度计等，用于蛋白浓度测定与样品质量评估。
所有仪器均建立有完善的维护保养与期间核查制度，并定期采用标准物质进行性能验证，确保仪器状态稳定、检测数据可信。
应用领域
β-羟基丁酰化修饰丰度绝对定量测定在生命科学与医学研究的多个方向均有广泛应用：
- 代谢性疾病研究：糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝等疾病中酮体代谢异常的表观遗传机制解析；
- 神经科学研究：生酮饮食干预癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统疾病的分子机制探索；
- 肿瘤研究：酮体代谢重编程与肿瘤增殖、转移、耐药的关联研究，以及相关靶点的发现与验证；
- 心血管研究：心力衰竭、心肌缺血等病理状态下心肌能量代谢与修饰调控网络研究；
- 运动与营养科学：运动干预、禁食模拟饮食、生酮膳食对修饰水平的动态影响评估；
- 衰老与抗衰老研究：热量限制及衰老进程中的翻译后修饰变化规律挖掘；
- 药物研发：靶向酮体代谢或去酰基化酶的药物活性评价与药效生物标志物开发；
- 基础表观遗传学：酰基转移酶、去酰基化酶及阅读蛋白的功能机制研究。
常见问题
问题一：β-羟基丁酰化修饰丰度绝对定量测定的检测周期是多久？
一般情况下，β-羟基丁酰化修饰丰度绝对定量测定的检测周期为7-15个工作日。具体交付时间受多重因素影响：检测位点或项目数量越多、样品数量越大，所需周期相应延长；若目标位点需要新方法开发与验证，或样品基质复杂需要额外优化前处理流程，周期会有所增加；如客户有紧急需求，可与技术人员沟通安排加急处理，在保证数据质量的前提下尽量压缩周期。项目正式启动前，我们会在技术方案中与客户明确约定交付时间。
问题二：β-羟基丁酰化修饰丰度绝对定量测定的检测价格是多少？
β-羟基丁酰化修饰丰度绝对定量测定的价格需根据具体检测方案确定，无法一概而论。影响报价的主要因素包括：检测项目类型（组蛋白位点定量、非组蛋白位点定量还是总修饰水平定量）、检测位点数量、样品数量与类型、是否需要定制方法开发、所需同位素标记内标的种类与用量、检测周期要求以及最终报告的具体内容等。不同客户的实验设计差异较大，建议在送样前与我们的技术支持人员充分沟通检测需求，获取针对性的实验方案与正式报价。
问题三：β-羟基丁酰化修饰丰度绝对定量测定测试需要什么资质？
我们旗下拥有CMA和CNAS资质，检测能力覆盖蛋白质组学与修饰组学相关检测领域，可满足科研、企业及机构客户对检测数据权威性与合规性的要求。同时，我们组建了由质谱分析、蛋白质化学与生物信息学专业人员构成的技术团队，核心成员具有丰富的靶向定量方法开发经验；实验室配备高分辨质谱与三重四极杆质谱等先进仪器设备，并建立了完善的质量管理体系，从样品接收、前处理、上机检测到数据分析全流程受控，确保每一份检测数据科学、准确、可追溯。
问题四：绝对定量与相对定量有什么区别？为什么选择绝对定量？
相对定量仅能给出样品之间修饰水平的比值或倍数变化，结果依赖对照样品的选取，不同批次实验之间难以直接比较；绝对定量通过掺入已知浓度的稳定同位素标记内标，直接给出修饰肽段的绝对含量（如fmol/μg蛋白），不受上样量波动、仪器状态变化的影响，准确度和重复性更高，可与文献报道值及其他实验室数据进行横向比较，特别适合生物标志物研究、临床样本队列分析以及需要长期跟踪的课题。
问题五：样品应如何准备与寄送？
组织样品采集后应迅速用预冷PBS冲洗去除血液等杂质，吸干水分后分装，液氮速冻并-80℃保存；细胞样品经PBS清洗、离心收集细胞沉淀后-80℃保存。所有样品务必使用足量干冰寄送，避免反复冻融，严禁室温或冰袋运输。寄送前建议与技术支持确认样品类型、数量及保存条件，并在送样单中详细注明样品信息，以确保样品状态满足检测要求。
问题六：检测报告包含哪些内容？
标准检测报告包含：样品信息与实验流程描述、检测方法与仪器参数、标准曲线与内标信息、目标位点修饰肽段的色谱图与质谱图、绝对定量结果（以fmol/μg蛋白等绝对单位表示）、修饰化学计量比（如适用）、方法学验证数据（线性范围、检出限、定量限、精密度、回收率）以及结果分析与专业解读。原始数据文件也可根据客户需要一并交付，支持后续数据挖掘与论文发表。
问题七：如果目标位点不在已有检测列表中，可以开展检测吗？
可以。对于客户指定的特殊蛋白或特殊位点，我们提供定制化方法开发服务。技术人员会根据目标蛋白序列设计候选修饰肽段，评估酶切方案与肽段的质谱响应特性，合成对应的重同位素标记内标肽段，优化色谱分离与质谱采集方法，并完成线性范围、灵敏度、精密度等方法学验证后再正式检测。方法开发周期会根据位点难度有所不同，欢迎提前与技术支持沟通具体需求，我们将为您量身定制检测方案。
