牛视网膜可溶性抗原诱导大鼠葡萄膜视网膜炎模型

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使用牛视网膜可溶性抗原免疫后,大鼠可能会发生葡萄膜视网膜炎症反应症状,最长可持续到免疫后第23天。23天后,大部分大鼠可观察到光感受器外段破坏,这表明长时间的炎症反应导致了视网膜的变化。

1. 模型制作方法

在制作该模型时,首先需要使用健康无眼病的Wistar大鼠,体重为150g,并使用牛视网膜可溶性抗原作为免疫剂量。

(1) 牛视网膜可溶性抗原的提取:新鲜的牛视网膜50只,首先进行匀浆、盐析、透析、离心等操作,然后取上清液,使用二乙基胺乙基-琼脂糖凝胶,C柱进行离子交换层析分离纯化S-Ag。

装柱时填充约85ml凝胶,使用pH7.5的含三羟基氨基甲烷的盐酸层析缓冲液,流洗平衡凝胶柱后,加入牛视网膜上清液样品,继续层析缓冲液洗柱(流速50ml/h)至蛋白峰回落基线。使用0-0.4mol/L氯化钠线性洗脱,10个柱体积(100ml/h),每5ml收集1管(紫外线280nm监测)。S-Ag峰样品在4℃双蒸水透析24小时,移入玻璃瓶中,置-30℃保存。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色可显示S-Ag为一主带,相对分子量为52×103。等电聚焦电泳S-Ag条带,等电点为6.2,抗原分析结束后冻干,可在30℃保存。

(2) 大鼠葡萄膜视网膜炎模型的制作:将完全弗氏佐剂与等量牛视网膜S-Ag混匀,制成乳剂,S-Ag终浓度为1.35mg/ml。接下来,需要在大鼠双足底部各注射0.1ml,计270μg/只,前期实验分别使用100μg、200μg、300μg S-Ag免疫大鼠诱发葡萄膜视网膜炎,经比较发现S-Ag 200~300μg 为最佳免疫剂量。同时,每只大鼠尾静脉注射10×109个菌体的灭活百日咳杆菌溶液,腹腔注射0.1ml大肠杆菌超声粉碎离心后的上清液。造模23天后,可以进行检查。

2. 观察指标与分析

进行视网膜病理学检查时,可以发现S-Ag免疫23天后,大部分大鼠均存在光感受器外段破坏的情况。此外,该模型还会引起炎症细胞浸润的种类、数量和部位、组织结构改变和破坏程度的不同。

其中,轻度病例视网膜内界膜增厚,炎症反应性均质样淀粉物质沉积或伴有局部空泡形成;神经节细胞和视网膜内丛状层空泡样变;视网膜色素上皮细胞肿胀、空泡样变性、结构紊乱;虹膜或睫状体充血,脉络膜增厚(类上皮细胞浸润),偶见炎症细胞浸润(主要为淋巴细胞)。

在中度病例中,可以在上述改变基础上可见虹膜、睫状体或玻璃体腔内少量炎症细胞浸润;内界膜、内丛状层、内核层可见局限性炎症灶(炎症细胞聚集);脉络膜血管壁增厚,血管炎性反应。

在重度病例中,大鼠常常会出现虹膜、睫状体、脉络膜和视网膜各层组织中炎症细胞浸润数量增多的情况,玻璃体弥漫性炎症细胞渗出;有的眼脉络膜明显呈炎症性增厚,以淋巴细胞浸润为主;眼组织结构也会遭到破坏。

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