牛S抗原诱发大鼠葡萄膜视网膜炎模型

使用混合了牛S抗原和完全弗氏佐剂的乳剂免疫大鼠,使其免疫14天后,在眼球玻璃体腔内接种牛S抗原,成功复制了大鼠抗原诱导性葡萄膜视网膜炎模型。

1. 模型制作方法

使用体重为140-180克、雌性的Wistar大鼠。

(1) S抗原的提纯:新鲜的牛视网膜冰浴下研磨成匀浆。离心(12000rpm,60min),取上清液后,加入饱和的硫酸铵,放入4℃过夜透析。再离心(4000rpm,30min),弃掉上清液并加入去离子水溶解沉淀,然后将其移至透析袋中,在0.15mol/L的氯化钠溶液中透析24小时(共换液3次),之后放入2.5mmol/L的二羟基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris.HCl)中透析24小时(共换液3次)。透析后的样品再次离心(12000rpm,4℃,60min),取上清液用于层析。使用DEAE2 Sepharose FF凝胶,XK26柱(2.6cm×16cm),每批用50毫升凝胶充填40个视网膜。常规层析缓冲液为3个柱体积(20mmol/L Tris.HCl,0.01%叠氮钠,pH7.5),加样后先用3-5个柱体积的缓冲液进行洗脱,流速为4-7毫升/分钟,直到杂纯部分回落到基线以下。之后使用0-0.4mol/L的氯化钠线性洗脱,流速为2毫升/分钟,共用了8个柱体积进行洗脱。使用高盐、碱和乙醇对柱体进行再生、清洗和消毒。

(2) 将S抗原(1mg/mL)和完全弗氏佐剂混合成乳剂,取0.2毫升皮下注射于大鼠後足底部,使之致敏。14天后,将10微克的牛S抗原接种于实验鼠右眼玻璃体腔,建立抗原诱导性葡萄膜视网膜炎(AIU)模型。抗原注射于玻璃体腔的方法是,使用氯胺酮加氯丙嗪混合液(各含25-50mg/kg,肌肉内注射)麻醉大鼠,然後用托吡卡胺扩瞳和1%的丁卡因表面麻醉,穿刺前房后,在睫状体平坦部位使用微量进样器插入含有10微克牛S抗原的PBS溶液10微升的玻璃体腔中。

2. 观察指标与分析

(1) 症状:模型组大鼠于玻璃体腔注射后1天,即出现以眼后节段为主的严重葡萄膜炎表现。

(2) 病理学检查:在光镜下观察可见,葡萄膜视网膜炎急性期(玻璃体腔注射后1-5天取材)出现了全葡萄膜炎的病理变化,主要表现为前房炎症细胞渗出,玻璃体腔中有大量炎症细胞和蛋白质渗出物,葡萄膜和视网膜增厚,并有炎症细胞浸润,重者还会导致感光细胞的破坏。在晚期(玻璃体腔注射10天后取材)可见视网膜局限性炎性反应。

(3) 血清抗体效价测定:通过双向免疫扩散法测出S抗原和抗血清之间出现清晰的反应带,血清抗体滴度为1:8-1:16。

特点:利用牛黑色素诱导的大鼠葡萄膜炎(EMIU)与人类急性前部葡萄膜炎(AAu)有着很大的相似之处,二者的病程持续时间相似,分别为6周和1个月,眼部症状相似,如虹膜血管充血扩张、前房纤维渗出和白细胞渗出、虹膜粘连等。不同之处在于,EMIU通常导致双眼炎症,而AAU通常只在年轻男性发生,而且EMIU通常在各年龄段的不同性别的大鼠都可以发生。因此,EMIU是研究人类葡萄膜炎的很好的动物模型。

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